Водорода потиска прогресията на рак на белия дробНаучно Изследване
Публикувано на: 28/04/2020
Водородният газ потиска прогресията на рак на белия дроб чрез понижаващо регулиране на CD47
Published online 2020 Apr 28. doi: 10.1042/BSR20192761Резюме
Установено е, че водородният газ (H 2 ) играе антитуморна роля при няколко вида рак, но молекулярните механизми остават до голяма степен неизвестни. В предишния нашето изследване, проекта група установено, че Н 2 може да намали експресията на CD47 в белодробен рак А549 клетки чрез последователността от следващо поколение, което показва, че CD47 може да бъде включен в Н 2 медиирана рак на белия дроб репресия. Следователно, настоящото проучване има за цел да изследва ефектите на CD47 върху H 2-индуцирана репресия на рак на белия дроб. Western blotting и PCR в реално време (RT-PCR) анализи бяха използвани за откриване на нивата на протеини и съответно иРНК. Клетъчната пролиферация, инвазия, миграция и апоптоза бяха открити чрез използване на комплекта за преброяване на клетки-8 (CCK-8), камери на Transwell, анализи за заздравяване на рани и проточна цитометрия, съответно. Резултатите показват, че Н 2 лечение причинява намаляване на нивата на експресия на CD47 и контрол на клетъчно делене протеин 42 (Cdc42) в доза-зависим начин. Регулиране нагоре на CD47 премахнати Н 2 роли в насърчаването на рак на белия дроб клетъчна апоптоза и потискане на клетъчния растеж, инвазия и миграцията на А549 както и H1975 клетъчни линии. Въпреки това, нокдаунът на CD47 засилва ролята на H 2 в инхибирането на рак на белия дроб. Освен това, ние също така забелязахме, че H2 лечение индуцира очевидни инхибиции в нивата на експресия на CDC42 и CD47 в туморни тъкани на мишки, както и подсилена медиирана от макрофаги фагоцитоза в A549 и H1975 клетки. В заключение, настоящото проучване разкрива, че H 2 инхибира прогресията на рак на белия дроб чрез понижаващо регулиране на CD47, което може да бъде мощен метод за лечение на рак на белия дроб.
Ключови думи: CD47, водороден газ (H2), рак на белия дроб, фагоцитоза, туморен растежВъведение
Ракът на белия дроб е най-често срещаният злокачествен тумор и основната причина за смъртни случаи, свързани с рака в целия свят. Изчислено е, че новодиагностицираните случаи на рак на белия дроб представляват ∼12,9% сред всички нови случаи на тумори през 2012 г. [ 1 ]. Недребноклетъчният рак на белия дроб (NSCLC) представлява приблизително 85% от всички видове рак на белия дроб, като 5-годишната преживяемост при пациенти в стадий IV е по-малка от 1% [ 2 ]. Повечето пациенти с NSCLC ще развият метастази, когато бъдат диагностицирани за първи път [ 3 , 4 ], губейки идеалното време за операция. Ето защо е от съществено значение да се намерят нови ефективни стратегии за лечение за подобряване на изхода при пациенти с NSCLC.
Водородният газ (H 2 ), като вид ендогенен газ, е идентифициран не само като важен енергиен източник, но също така изпълнява важни физиологични регулаторни роли [ 5 ]. Молекулите на водорода могат да навлизат в тъканите и да упражняват противовъзпалителни, антиоксидантни и антиапоптотични роли [ 6 ]. Още през 1975 г. Dole et al. [ 7 ], представени за първи път, че Н 2 има способността за лечение на рак. В нашето предишно проучване открихме, че прилагането на H 2 значително потиска клетъчната пролиферация, миграция и инвазия на рак на белия дроб A549 и H1975 и индуцира клетъчна апоптоза [ 8 ]. Въпреки това, молекулярните механизми все още остават до голяма степен неизвестни.
CD47 е трансмембранен гликопротеин, който е широко експресиран в нормалните тъкани и медиира сигнализирането „само/не ме яж“ чрез потискане на макрофаговата фагоцитоза [ 9 , 10 ]. Съобщава се, че CD47 често се регулира нагоре при множество видове рак, като рак на яйчниците [ 11 ], рак на стомаха [ 12 ], рак на гърдата [ 13 ] и NSCLC [ 14 ]. Забележително е, че е установено, че CD47 индуцира имунологичното избягване на раковите клетки и се счита за потенциална цел за лечение на рак [ 15 , 16 ]. Използвайки техниката на секвениране, открихме, че H 2предизвиква значително намаляване на CD47 експресия в белодробен рак А549 клетки, но време CD47 участва в Н 2 медиирано инхибиране на прогресията на рак на белия дроб остава неясно.
В настоящото проучване ние имахме за цел да изясним ролите на CD47 в H 2- медиираното инхибиране на прогресията на рак на белия дроб чрез провеждане както in vivo, така и in vitro експерименти.
Материали и методи
Клетъчни линии и култура
Две клетъчни линии от рак на белия дроб A549 и H1975 клетки бяха закупени от American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA). Клетките A549 се култивират в F-12K среда (Gibco, Thermo Fisher Scientific, MA, USA), допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS; Gibco). Клетките H1975 се отглеждат в среда RPMI-1640 (Gibco), допълнена с 10% FBS. Всички клетъчни линии се държат в инкубатор при 37 ° С с 5% СО 2 .
H 2 лечение
А549 и H1975 клетки бяха култивирани в 20, 40 и 60% Н 2 с помощта на водород машина (Shanghai Nanobubble технология Co., Ltd., Shanghai, Китай) за различни времена, и 5% СО 2 rved като контрола отрицателен.
Клетъчна трансфекция
Вектори, използвани за свръхекспресия на CD47 (OE-CD47) и малките интерфериращи РНК (siRNAs), използвани за заглушаване на CD47 (si-CD47), както и техните отрицателни контролни вектори (OE-NC, si-NC) са получени от GenePharma ( Шанхай, Китай). Клетките A549 и H1975 бяха трансфектирани с тези вектори, като се използва Lipofectamine 2000 трансфектиран реагент (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), като се позовава на инструкциите на производителя.
Количествен PCR анализ в реално време
Общите РНК се екстрахират от клетки с помощта на RNApure Tissue & Cell Kit (DNase I) в съответствие с инструкциите на производителя (CWBio, Пекин, Китай). След това, общо 1 μg РНК от всяка проба се подлага на обратна транскрипция на сДНК и PCR в реално време (RT-PCR), като се използва комплект Quant One Step RT-PCR (TIANGEN, Пекин, Китай) на система за откриване на Bio-Rad ( Bio-Rad, Hercules, CA) след количествено определяне на РНК чрез използване на ND-1000 NanoDrop спектрофотометър (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, Delaware). Нивото на експресия на GAPDH служи като вътрешна референция. Праймерите бяха изброени, както следва,
CD47: напред (F) 5′-CGGCGTGTATACCAATGC-3′; Обратно (R) 5′-TTTGAATGCATTAAGGGGTTCCT-3′;
GAPDH: F 5′-CCACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3′; R 5′-ACTCCGACCTTCACCTTCCC-3′.
Western blotting анализ
Общите протеини се екстрахират от клетки, като се използва RIPA лизисен буфер (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай), допълнен с протеазен инхибитор за 30 минути при 4 ° С. След количествено определяне с BCA Protein Kit (Bio-Rad Laboratories, Калифорния, САЩ), 30 μg протеини от всяка проба бяха разделени с 10% полиакриламидни гелове и бяха прехвърлени към поливинилиден дифлуоридните мембрани (Millipore, Billerica, MA, USA). След това мембраните се инкубират с 5% обезмаслено мляко и се изследват с първичните антитела за една нощ при 4°C, включително Bcl-2 (1:1000 разреждане; № #3498, Cell Signaling Technology, MA, USA), разцепена каспаза3 (разреждане 1:1000; № 9661, технология за клетъчна сигнализация), каспаза3 (разреждане 1:1000; № #9662, технология за клетъчна сигнализация), разцепен PARP (разреждане 1:1000; #5625, технология за клетъчна сигнализация), PARP ( 1:1000 разреждане; #9532, клетъчна сигнална технология), CD47 (1:1000 разреждане; № #63000, клетъчна сигнална технология), протеин за контрол на клетъчното делене 42 (CDC42) (разреждане 1:1000; № #2462, клетъчна сигнална технология), β-актин ( 1:2000 разреждане; № #4970, технология за клетъчна сигнализация). След инкубиране със съответните втори антитела (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), протеиновите експресии бяха изследвани на Western blotting изображения и количествена система (Bio-Rad) след инкубиране с хемилуминесцентен ECL реагент (Millipore). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (Национални здравни институти) след фон на изваждане, с експресия на β-актин като вътрешна референция. 1000 разреждане; № #2462, клетъчна сигнална технология), β-актин (1:2000 разреждане; № #4970, клетъчна сигнална технология). След инкубиране със съответните втори антитела (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), протеиновите експресии бяха изследвани на Western blotting изображения и количествена система (Bio-Rad) след инкубиране с хемилуминесцентен ECL реагент (Millipore). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (Национални здравни институти) след фон на изваждане, с експресия на β-актин като вътрешна референция. 1000 разреждане; № #2462, клетъчна сигнална технология), β-актин (1:2000 разреждане; № #4970, клетъчна сигнална технология). След инкубиране със съответните втори антитела (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), протеиновите експресии бяха изследвани на Western blotting изображения и количествена система (Bio-Rad) след инкубиране с хемилуминесцентен ECL реагент (Millipore). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (Национални здравни институти) след фон на изваждане, с експресия на β-актин като вътрешна референция. протеиновите експресии бяха изследвани на Western blotting образна и количествена система (Bio-Rad) след инкубиране с хемилуминесцентен ECL реагент (Millipore). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (Национални здравни институти) след фон на изваждане, с експресия на β-актин като вътрешна референция. протеиновите експресии бяха изследвани на Western blotting образна и количествена система (Bio-Rad) след инкубиране с хемилуминесцентен ECL реагент (Millipore). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (Национални здравни институти) след фон на изваждане, с експресия на β-актин като вътрешна референция.
Анализ на комплект за броене на клетки-8
За откриване на клетъчна пролиферация беше използван тест за преброяване на клетки-8 (CCK-8). Накратко, А549 и H1975 клетки се посяват в 96-ямкови плаки при плътност 3 х 10 3 клетки / ямка и се култивират при 37 ° С една нощ, след това клетките бяха дадени Н 2 лечение и / или клетъчна трансфекция. След инкубиране при 37°C за посочените времена, средата за клетъчна култура се заменя с 10 μl CCK-8 реагент (Beyotime, Пекин, Китай) и 90 μl прясна среда и клетките се инкубират при 37°C за още 4 з. Абсорбцията при 450 nm се измерва с четец на плаки (модел 680; Bio-Rad, Hertfordshire, UK).
Анализ с поточна цитометрия
Тестът с поточна цитометрия беше извършен за оценка на клетъчната апоптоза. Накратко, различни третирани клетки A549 и H1975 бяха събрани и подложени на тест за апоптоза, използвайки комплекти за откриване на апоптоза на Анексин V (FITC)/пропидиев йодид (PI) (Dojindo, Япония). Скоростта на клетъчна апоптоза се открива чрез използване на поточна цитометрия (Beckman Coulter, CA, USA) и се анализира с помощта на софтуер FlowJo 7.6 (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).
Анализ за заздравяване на рани
Анализът за заздравяване на рани беше използван за откриване на способността за клетъчна миграция. Накратко, клетките A549 и H1975 се поставят в плаки с шест ямки при концентрация от 5 × 10 5 клетки/ml и се инкубират при 37°С за една нощ, последвано от различни клетъчни трансфекции. Раните се правят с помощта на 20 μl накрайници на пипета, когато клетъчното сливане достигне 100%, и злорадстващите клетки се отстраняват чрез промиване с PBS. След това, клетките се култивират при 37 ° С с 60% Н 2 приложение или не. Изображенията на движението на клетките към зоната на надраскване се правят на всеки 6–12 часа с помощта на микроскоп.
Камерен анализ на Transwell
Transwell камери с 8-μm поликарбонатни филтри (BD Bioscience, Сан Диего, Калифорния, САЩ) бяха приложени за оценка на клетъчната инвазия. При процедурата камерите бяха покрити с Matrigel от долната страна. След това приблизително 2 × 10 5 от клетки A549 или H1975, ресуспендирани със среда без FBS, бяха посяти в горната камера, докато 600 μl среда, допълнена с 20% FBS, бяха добавени в долната камера. След 48 часа инкубация при 37 ° С с 5% СО 2 или 60% Н 2 , клетки в горната част на мембраните бяха отстранени като се използва памук пъпки и клетки в долната част на мембраната са фиксирани и оцветени с 0.2% кристал виолет ( Соларбио, Пекин, Китай). Оцветените клетки бяха преброени под светлинен микроскоп (увеличение: 200 ×), за да се оцени клетъчната инвазивност.
Експеримент in vivo
Експеримент с животни е извършен в Третата болница на Медицинския университет Хебей от Wang et al. [ 8 ] в съответствие с Насоките на Националния здравен институт за грижа и използване на лабораторни животни и е получил разрешение от Комитета за грижи и изследвания на животните на Третата болница на Медицинския университет Хебей. Четириседмични мъжки BALB/c athymic голи мишки (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology, Пекин, Китай) бяха хранени в специфични условия без патогени. Общо 1 × 10 7 A549 клетки, суспендирани в 200 μl PBS, бяха инжектирани в мишките BALB/c, които след това бяха разделени на три групи, когато туморите бяха нараснали с диаметър 3-4 mm, това бяха H 2 група, cis – платинена група и контролна група. Мишки в H 2група получиха 60% Н 2 вдишване на 2 часа всеки ден, мишките в цис- платинум група получи цис- платинум (10 мг / кг телесно тегло) [ 17 ] интраперитонеално инжектиране. Н 2 и цис- платинум лечения са били държани в продължение на 4 седмици. След това мишките бяха убити чрез цервикална дислокация. Атмосфера се използва като контрол на 60% H 2 и същото количество разтвор бяха служи като контрола за цис- платинум.
In vitro анализ за фагоцитоза
Способността за медиирана от макрофаги фагоцитоза е измерена според предишно проучване [ 18 ]. Накратко, 1 × 10 5 макрофаги бяха посяти в съдовете за култура със стъклено дъно. След това клетките A549 и H1975 бяха белязани с 20 μM CFDA-SE, използвайки Vybrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (Invitrogen), които след това бяха инокулирани в културата на макрофаги. Макрофагите се промиват и след това се снимат с конфокален микроскоп. Фагоцитният индекс се оценява чрез броя на фагоцитираните карбокси флуоресциращи в сукцинимидил естер (CFSE)-позитивни клетки на 100 макрофаги.
Оцветяване с хематоксилин и еозин и имунохистохимично
Мишките проби тъкан от Н 2 , цис- платинум и контролните групи бяха внесени от Wang и сътр. [ 8 ]. Раковите тъкани бяха отстранени и подложени на оцветяване с хематоксилин и еозин (HE) и имунохистохимия (IHC), за да се оцени хистопатологията и протеиновите експресии на CD47 и CDC42, като се позовават на следните процедури. Накратко, вградените в парафин ракови тъкани бяха нарязани на 4-μm участъци, последвано от срезове, обезпарафинирани и хидратирани и инкубирани с 3% H 2 O 2за 10 минути и извличане на антиген с помощта на Tris-EDTA. След това секциите се запечатват с 5% кози серум и след това се изследват с анти-CD47 (1:200 разреждане; No. ab175388, Abcam, Кеймбридж, Масачузетс, САЩ) или анти-CDC42 (1:150 разреждане; № ab64533, Abcam ) антитяло за една нощ при 4°С и съответното вторично антитяло. След трикратно промиване с PBS, срезовете се инкубират с хромоген 3,3′-диаминобензидинтетрахлорид (DAB) (Serva, Хайделберг, Германия), който служи като субстрат.
Статистически анализ
Всеки експеримент в настоящото изследване е извършен в три екземпляра. Сравнението на статистическа значимост между две групи и множество групи беше извършено чрез използване на t теста на Student и съответно еднопосочен ANOVA. Анализът на данните беше извършен с помощта на GraphPad Prism (версия 6.0, La Jolla, CA, USA). Р <0,05 се счита за статистически значим.
Резултати
Приложението на H 2 потиска злокачествената трансформация на раковите клетки на белия дроб
Първо, ние изследва ролята на 60% Н 2 приложение в прогресията на рак на белия дроб ин витро . В сравнение с контролната група, клетъчната пролиферация (Фигура 1A,B), инвазия (Фигура 1В) и миграция (Фигура 1D, E) способности са всички значително потиснати, когато клетките бяха дадени 60% Н 2 лечение в А549 както и H1975 клетъчни линии. В допълнение, клетки апоптозата проценти в двата А549 и очевидно H1975 клетки се увеличават в Н 2 групи, в сравнение с тази на контролната група (Фигура 1F), придружено с намалена експресия на Bcl-2 и повишаване на нивата на разцепена каспаза3/каспаза3 и разцепена PARP/PARP (Фигура 1G). Тези резултати предполагат, че Н 2 лечение може да потисне развитието на рак на белия дроб ин витро .
Лечението с H 2 инхибира клетъчната пролиферация, миграция и инвазия и индуцира клетъчна апоптоза в клетки A549 и H1975
ССК-8 анализ се използва за откриване на клетъчната пролиферация, след като клетките се третират с 60% H 2 за 12, 24, 36, 48 и 72 часа в ( А ) А549 и ( B ) H1975 клетки. ( C ) способност клетъчна инвазия се определя чрез използване на камерите Transwell след 48 часа от третирането на клетките с 60% Н 2 . ( D, Е ) заздравяване на рани анализ се използва за оценка на клетъчната миграция способност след 24 часа от третирането на клетките с 60% Н 2 . ( F ) Ефектите на Н 2 лечение на клетъчна апоптоза се определят чрез анализ на поточна цитометрия в А549 и H1975 клетки. ( Г) Western блотинг се извършва до откриване на изразите на Bcl-2, разцепен caspase3, caspase3, срязания PARP и PARP след 48 часа от третирането на клетките с 60% Н 2 (* Р <0.05, ** Р <0.01).
Лечението с H 2 понижава експресията на CD47 и CDC42 при рак на белия дроб
Нашите изследвания група показа, че по-рано Н 2 лечение може да предизвика значително намаляване на CD47 експресия [ 8 ], което показва, че CD47 може да бъде включен в Н 2 медиирано инхибиране на рак на белия дроб. За тази цел, ние използвахме Western блотинг анализ, за да се проучи ефекта на Н 2 лечение на експресията на CD47. В сравнение с контролната група, тРНК и протеин нивата на експресия на CD47 бяха значително намалява при А549 и H1975 клетки бяха третирани с 60% Н 2 (Фигура 2А, Б). Освен това, лечението с H 2 намалява експресията на CD47 и CDC42 по дозозависим начин в A549 (Фигура 2C) и клетки H1975 (Фигура 2Д). Тези резултати показват, че H 2 отрицателно регулира експресията на CD47 и CDC42 при рак на белия дроб.
Лечението с H 2 намалява експресията на CD47 и CDC42 в клетките A549 и H1975
След 48 часа на клетъчната третиране с Н 2 , А549 и H1975 клетки се събират и се подлага на РНК и ДНК екстракция със следните откривания. ( A,B ) Нивата на иРНК и протеин на CD47 бяха открити чрез RT-PCR и Western blotting анализи. ( С, D ) експресионни нива на протеин CD47 и cdc42 се открива чрез Western блотинг в клетъчни лечения с различни концентрации на Н 2 (* Р <0.05, ** Р <0.01).
Нокдаунът на CD47 си сътрудничи с H 2 за потискане на прогресията на рак на белия дроб
След това се извършва анализ на загуба на функция, за да се изследва ролята на CD47 в Н 2 медиирана репресия рак на белия дроб. В сравнение с групата si-NC, експресията на CD47 беше значително намалена, когато клетките A549 и H1975 бяха трансфектирани със si-CD47, а si-CD47-3 показа най-добрата ефективност на нокдаун (Фигура 3А). В сравнение с контролната група, клетъчната пролиферация (Фигура 3Б), инвазия (Фигура 3В) и миграция (Фигура 3D, E) капацитет бяха значително намалява, когато клетките бяха трансфектирани с SI-CD47 или третира с 60% Н 2 . В допълнение, както понижаването на лечението с CD47 и H 2 индуцира значително увеличение на скоростта на клетъчна апоптоза (Фигура 3F,G) и намалява експресията на Bcl-2 и CDC42, както и повишаването на нивата на разцепената каспаза3/каспаза3 и разцепената PARP/PARP (Фигура 3H). Забележимо е, че комбинацията от si-CD47 с лечение с H 2 показва по-висока ефективност от лечението със si-CD47 или H 2 самостоятелно (Фигура 3B–H). Тези открития илюстрират, че понижаването на CD47 може да засили ефекта на H 2 върху потискането на прогресията на рак на белия дроб.
Нокдаунът на CD47 си сътрудничи с H 2 за потискане на прогресията на рак на белия дроб
А549 и H1975 клетки, трансфектирани с SI-CD47 или си-NC се третира с 60% Н 2 , след това бяха извършени следните анализи. ( A ) Western blotting анализът беше използван за откриване на ефективността на нокдаун на si-CD47 в клетки A549 и H1975. ( B ) CCK-8 анализът беше използван за откриване на клетъчна пролиферация. ( C ) Transwell камери бяха приложени за оценка на клетъчната инвазия. ( D,E ) Анализът за заздравяване на рани беше използван за откриване на способността за клетъчна миграция. ( F, G ) Ефектите на Н 2 лечение на апоптоза на А549 и H1975 клетки се определя чрез анализ на поточна цитометрия. ( Х) Проведено е Western блотиране за откриване на експресиите на CD47, CDC42, Bcl-2, разцепена каспаза3, каспаза3, разцепена PARP и PARP след 48 часа клетъчно третиране с 60% H 2 (* P <0,05, ** P <0,01 спрямо контролна група; # P <0,05, ## P <0,01 срещу H 2 група).
Свръхекспресията на CD47 нарушава ролята на H 2 в потискането на прогресията на рак на белия дроб
За да се разкрие ролята на CD47 в Н 2 медиирано инхибиране на рак на белия дроб, ние също извършва анализ на печалба-на-функция. Експресията на CD47 очевидно е повишена, когато клетките A549 и H1975 са трансфектирани с OE-CD47 (Фигура 4А). За разлика от ролите на H 2 в промяната на функциите на рак на белия дроб, клетъчната пролиферация (Фигура 4Б), инвазия (Фигура 4В) и миграция (Фигура 4D,E) способностите бяха очевидно подобрени, когато клетките бяха трансфектирани с OE-CD47. Освен това, свръхекспресията на CD47 значително инхибира клетъчната апоптоза (Фигура 4F,G) и повишава експресията на Bcl-2, като същевременно намалява нивата на експресия на разцепената каспаза3/каспаза3 и разцепената PARP/PARP (Фигура 4H). Освен това, CD47 свръхекспресия значително премахва Н 2 роли в задръжки на клетъчен растеж, миграция, инвазия и Bcl-2 експресията, както и промоции на клетъчна апоптоза и изразите на разцепен caspase3 / caspase3 и разцепен PARP / PARP (Фигура 4B–H). Тези резултати потвърждават, че Н 2 лечение инхибира прогресията на рак на белия дроб чрез намаляване на CD47 експресия.
Свръхекспресия на CD47 нарушена Н 2 роля в потискане на развитието на рак на белия дроб
А549 и H1975 клетки, трансфектирани с OE-CD47 или OE-NC се третира с 60% Н 2 , след това бяха извършени следните анализи. ( A ) Western blotting анализът беше използван за откриване на протеиновата експресия на CD47, след като клетките A549 и H1975 бяха трансфектирани с OE-CD47 или OE-NC. ( B ) CCK-8 анализът беше използван за откриване на клетъчна пролиферация. ( C ) Transwell камери бяха приложени за оценка на клетъчната инвазия. ( D,E ) Анализът за заздравяване на рани беше използван за откриване на способността за клетъчна миграция. ( F, G ) Ефектите на Н 2 лечение на апоптоза на А549 и H1975 клетки се определя чрез анализ на поточна цитометрия. ( Х) Проведено е Western блотиране за откриване на експресиите на CD47, CDC42, Bcl-2, разцепена каспаза3, каспаза3, разцепена PARP и PARP след 48 часа клетъчно третиране с 60% H 2 (* P <0,05, ** P <0,01 спрямо контролна група; # P <0,05, ## P <0,01 срещу H 2 група).
Лечението с H 2 потиска експресията на CD47 и CDC42 в тъканите на рак на белия дроб от in vivo мишки
В допълнение, ние изследвахме ролята на H 2 в прогресията на рак на белия дроб in vivo, използвайки проби от ракови тъкани от предишното ни проучване [ 8 ]. Както е показано на изображението на HE, туморните клетки са плътно опаковани и клетъчната атипия е очевидна в туморните тъкани на контролната група. В сравнение с контролната група, туморна клетъчна плътност и клетъчна атипия очевидно намалява в двата Н 2 и цис- платинум групи (Фигура 5А). В допълнение, нивата на експресия на CD47 и cdc42 са намалени в двата Н 2 и цис- платинум групи в сравнение с контролната група (Фигура 5Б). Както CD47 е регулатор на макрофаг-медиирана фагоцитоза [ 18 ], се предположи, че Н 2 може да играе роля в макрофаг-медиирана фагоцитоза. В съответствие с нашето предположение, ние наблюдавахме, че фагоцитният индекс е значително повишен, когато клетките A549 се прилагат с 60% H 2 в двете клетъчни линии A549 и H1975 (Фигура 5° С). Тези резултати потвърждават, че Н 2 лечение потиска развитието на рак на белия дроб чрез модулиране на CD47 експресия.
Н 2 лечение потиска развитието на рак на белия дроб ин виво
( A ) Оцветяването с HE беше извършено за оценка на хистопатологията на тъканите от рак на белия дроб от различни третирани мишки (мащабна лента = 200 μm). ( B ) IHC оцветяването беше използвано за оценка на експресията на CD47 и CDC42 в тъкани на рак на белия дроб от различни третирани мишки (мащабна лента = 200 μm). ( C ) Ин витро анализ фагоцитоза се използва за оценка на ефекта на Н 2 лечение на макрофаг-медиирана фагоцитоза в А549 и H1975 клетки (мащаб бар = 200 цт) (** Р <0.01).
Дискусия
Водородът представя лека редуктивна производителност без токсичност сама по себе си, което е полезно за предотвратяване и контролиране на сериозни странични ефекти на токсичност при медицински процедури [ 19 ]. Тъй като Dole et al. [ 7 ] представи, че Н 2 има способността за лечение на рак през 1975 г., Ohsawa и сътр. [ 6 ] установи, че водородът има антиоксидантна роля, която може селективно да елиминира реактивните кислородни видове (ROS) през 2007 г. Що се отнася до рака, както повишаването, така и намаляването на нивата на ROS може да наруши редокс хомеостазата и да доведе до редокс стрес, водещ до рак увреждане на клетките [ 20 , 21]. Това откритие предполага, че водородът упражнява своята противотуморна роля чрез промяна на интратуморното ниво на ROS. В допълнение, нашата изследователска група установи, че H 2 потиска прогресията на рак на белия дроб чрез регулиране на експресията на структурната поддръжка на хромозоми 3 (SMC3), която е важен регулатор на хромозомната кондензация [ 8 ]. С цел по-нататъшно изследване на механизма на H 2 при потискане на прогресията на рак на белия дроб, настоящото проучване илюстрира, че H 2 потиска прогресията на рак на белия дроб чрез понижаващо регулиране на CD47.
В настоящото изследване, ние наблюдавахме, че Н 2 лечение значително намалява нивата на експресиране на CD47 и cdc42 на. CD47, наричан също интегрин-асоцииран протеин, е 50-kDa клетъчен повърхностен гликопротеин и принадлежи към суперсемейството на имуноглобулините. CD47 е широко експресиран върху клетъчната повърхност и служи като антифагоцитна молекула чрез свързване със сигнален регулаторен протеин α (SIRPα) [ 22 , 23 ]. CDC42 е член на Rho семейството на малки GTPases и се активира от CD47, за да служи като решаващ регулатор на раковите метастази [ 24 ]. Все повече доказателства показват, че експресията на CD47 е повишена в туморни ракови тъкани и клетки, като рак на пикочния мехур [ 25 ], левкемия [ 26 ], рак на дебелото черво [27 ] и NSCLC [ 28 ]. Неговата свръхекспресия тясно корелира с лошата прогноза на пациентите и значително ускорената трансформация на туморни клетки в злокачествени фенотипове. Например, Majjeti et al. [ 26 ] съобщава, че CD47 е силно експресиран при остра миелоидна левкемия (AML) и повишеното му ниво на експресия прогнозира по-кратка обща преживяемост при възрастни пациенти с AML. Освен това, блокирането на CD47 с моноклонални антитела дава възможност за макрофагова фагоцитоза на стволови клетки на AML левкемия и инхибира тяхната туморогенеза in vivo . Инхибирането на CD47 с блокиращи антитела или трансфекцията на siRNA очевидно инхибира миграцията на SW480 клетки от рак на дебелото черво в присъствието на М2 макрофаги [ 27 ]. Yoshida et al. [ 29] съобщава, че CD47 е положително експресиран в 49,6% (57/115) тъкани на рак на стомаха и нивата на експресия са тясно свързани с лошата прогноза при рак на стомаха. Взети заедно, CD47 се идентифицира като често експресирана молекула при ракови заболявания и блокадата на неговата функция води до фагоцитоза и елиминиране на туморни клетки. Следователно, CD47 е предложена цел за терапии на рак [ 30 ]. Тук ясно, че Н 2 лечение може негативно модулират CD47 експресия, който може да бъде механизма, чрез който H 2 инхибира прогресията на рак на белия дроб.
За да се разкрие CD47 роли в Н 2 медиирана потискане на прогресирането на рак на белия дроб, ние проведохме тестове за печалба / загуба на функция. Наблюдавахме, че низходяща регулация на CD47 с SI-CD47 трансфекция значително подобрена Н 2 ефекти върху репресиите на клетъчна пролиферация, инвазия и миграция, и насърчаване на клетъчна апоптоза. Въпреки това, тези по-горе роли на Н 2 са очевидно отслабени когато CD47 се свръхекспресира. Тези резултати показват, че H 2 инхибира прогресията на рак на белия дроб чрез понижаващо регулиране на CD47.
Zhang et al. [ 31 ] съобщава, че блокирането на CD47 с нов CD47-насочен слят протеин SIRPaD1-Fc води до значително увеличение на медиираната от макрофаги фагоцитоза в NSCLC клетки, допълнително потвърждавайки антифагоцитната роля на CD47 при рак на белия дроб [ 28 ]. Въз основа на това предполагаме, че H 2 може също да упражнява антифагоцитна роля в клетките на рак на белия дроб. Последователно, ние открихме, че макрофаг-медиирана фагоцитоза е значително подобрена, когато клетките бяха третирани с Н 2 в А549 както и H1975 клетки. Освен това, Н 2 приложение може значително да облекчи патологична промяна на рак на белия дроб тъкани от ин виво мишки, както и причиняват очевидно намаляване на експресията на CD47 и CDC42.
В заключение, настоящото проучване изяснява, че H 2 упражнява антитуморна роля при рак на белия дроб чрез понижаващо регулиране на CD47, антифагоцитна молекула. Като повече и повече внимание е привлечен за прилагането на Н 2 терапия в клинични проучвания [ 32-34 ], H 2 терапия трябва да бъде предложен като обещаваща терапевтична стратегия за лечение на рак.
References
1. (2017) All cancers estimated incidence, mortality and prevalence of all cancers (excluding non-melanoma skin cancer) in 2012. J. Natl. Cancer Inst. 109, 10.1093/jnci/djx205 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]2. Travis W.D. (2011) Pathology of lung cancer. Clin. Chest Med. 32, 669–692 10.1016/j.ccm.2011.08.005 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3. Morgensztern D., Ng S.H., Gao F. and Govindan R. (2010) Trends in stage distribution for patients with non-small cell lung cancer: a National Cancer Database survey. J. Thorac. Oncol. 5, 29–33 10.1097/JTO.0b013e3181c5920c [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4. Carney D.N. and Hansen H.H. (2000) Non-small-cell lung cancer–stalemate or progress? N. Engl. J. Med. 343, 1261–1262 10.1056/NEJM200010263431710 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5. Zhao P., Jin Z., Chen Q., Yang T., Chen D., Meng J. et al. . (2018) Local generation of hydrogen for enhanced photothermal therapy. Nat. Commun. 9, 4241 10.1038/s41467-018-06630-2 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]6. Ohsawa I., Ishikawa M., Takahashi K., Watanabe M., Nishimaki K., Yamagata K. et al. . (2007) Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals. Nat. Med. 13, 688–694 10.1038/nm1577 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7. Dole M., Wilson F.R. and Fife W.P. (1975) Hyperbaric hydrogen therapy: a possible treatment for cancer. Science 190, 152–154 10.1126/science.1166304 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8. Wang D., Wang L., Zhang Y., Zhao Y. and Chen G. (2018) Hydrogen gas inhibits lung cancer progression through targeting SMC3. Biomed. Pharmacother. 104, 788–797 10.1016/j.biopha.2018.05.055 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]9. Baccelli I., Schneeweiss A., Riethdorf S., Stenzinger A., Schillert A., Vogel V. et al. . (2013) Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat. Biotechnol. 31, 539–544 10.1038/nbt.2576 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]10. Tsai R.K. and Discher D.E. (2008) Inhibition of “self” engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J. Cell Biol. 180, 989–1003 10.1083/jcb.200708043 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]11. Li Y., Lu S., Xu Y., Qiu C., Jin C., Wang Y. et al. . (2017) Overexpression of CD47 predicts poor prognosis and promotes cancer cell invasion in high-grade serous ovarian carcinoma. Am. J. Transl. Res. 9, 2901–2910 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]12. Sudo T., Takahashi Y., Sawada G., Uchi R., Mimori K. and Akagi Y. (2017) Significance of CD47 expression in gastric cancer. Oncol. Lett. 14, 801–809 10.3892/ol.2017.6257 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]13. Baccelli I., Stenzinger A., Vogel V., Pfitzner B.M., Klein C., Wallwiener M. et al. . (2014) Co-expression of MET and CD47 is a novel prognosticator for survival of luminal breast cancer patients. Oncotarget 5, 8147–8160 10.18632/oncotarget.2385 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]14. Barrera L., Montes-Servin E., Hernandez-Martinez J.M., Garcia-Vicente M.L.A., Herrera-Martinez M., Crispin J.C. et al. . (2017) CD47 overexpression is associated with decreased neutrophil apoptosis/phagocytosis and poor prognosis in non-small-cell lung cancer patients. Br. J. Cancer 117, 385–397 10.1038/bjc.2017.173 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]15. Rodriguez P.L., Harada T., Christian D.A., Pantano D.A., Tsai R.K. and Discher D.E. (2013) Minimal “Self” peptides that inhibit phagocytic clearance and enhance delivery of nanoparticles. Science 339, 971–975 10.1126/science.1229568 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]16. Kong F., Gao F., Li H., Liu H., Zhang Y., Zheng R. et al. . (2016) CD47: a potential immunotherapy target for eliminating cancer cells. Clin. Transl. Oncol. 18, 1051–1055 10.1007/s12094-016-1489-x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]17. Yang W., Yang X., Wang X., Gu J., Zhou D., Wang Y. et al. . (2019) Silencing CDR1as enhances the sensitivity of breast cancer cells to drug resistance by acting as a miR-7 sponge to down-regulate REGgamma. J. Cell. Mol. Med. 10.1111/jcmm.14305 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]18. Cabrales P. (2019) RRx-001 acts as a dual small molecule checkpoint inhibitor by downregulating CD47 on cancer cells and SIRP-alpha on monocytes/macrophages. Transl. Oncol. 12, 626–632 10.1016/j.tranon.2018.12.001 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]19. Cui J., Chen X., Zhai X., Shi D., Zhang R., Zhi X. et al. . (2016) Inhalation of water electrolysis-derived hydrogen ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury in rats – a possible new hydrogen resource for clinical use. Neuroscience 335, 232–241 10.1016/j.neuroscience.2016.08.021 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]20. Trachootham D., Alexandre J. and Huang P. (2009) Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms: a radical therapeutic approach? Nat. Rev. Drug Discov. 8, 579–591 10.1038/nrd2803 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]21. Kim J. and Bae J.S. (2016) ROS homeostasis and metabolism: a critical liaison for cancer therapy. Exp. Mol. Med. 48, e269 10.1038/emm.2016.119 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]22. Matozaki T., Murata Y., Okazawa H. and Ohnishi H. (2009) Functions and molecular mechanisms of the CD47-SIRPalpha signalling pathway. Trends Cell Biol. 19, 72–80 10.1016/j.tcb.2008.12.001 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]23. Ide K., Wang H., Tahara H., Liu J., Wang X., Asahara T. et al. . (2007) Role for CD47-SIRPalpha signaling in xenograft rejection by macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5062–5066 10.1073/pnas.0609661104 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]24. Chang J.S., Su C.Y., Yu W.H., Lee W.J., Liu Y.P., Lai T.C. et al. . (2015) GIT1 promotes lung cancer cell metastasis through modulating Rac1/Cdc42 activity and is associated with poor prognosis. Oncotarget 6, 36278–36291 10.18632/oncotarget.5531 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]25. Chan K.S., Espinosa I., Chao M., Wong D., Ailles L., Diehn M. et al. . (2009) Identification, molecular characterization, clinical prognosis, and therapeutic targeting of human bladder tumor-initiating cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 14016–14021 10.1073/pnas.0906549106 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]26. Majeti R., Chao M.P., Alizadeh A.A., Pang W.W., Jaiswal S., Gibbs K.D. Jr et al. . (2009) CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell 138, 286–299 10.1016/j.cell.2009.05.045 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]27. Zhang Y., Sime W., Juhas M. and Sjolander A. (2013) Crosstalk between colon cancer cells and macrophages via inflammatory mediators and CD47 promotes tumour cell migration. Eur. J. Cancer 49, 3320–3334 10.1016/j.ejca.2013.06.005 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]28. Zhao H., Wang J., Kong X., Li E., Liu Y., Du X. et al. . (2016) CD47 promotes tumor invasion and metastasis in non-small cell lung cancer. Sci. Rep. 6, 29719 10.1038/srep29719 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]29. Yoshida K., Tsujimoto H., Matsumura K., Kinoshita M., Takahata R., Matsumoto Y. et al. . (2015) CD47 is an adverse prognostic factor and a therapeutic target in gastric cancer. Cancer Med. 4, 1322–1333 10.1002/cam4.478 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]30. Willingham S.B., Volkmer J.P., Gentles A.J., Sahoo D., Dalerba P., Mitra S.S. et al. . (2012) The CD47-signal regulatory protein alpha (SIRPa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 6662–6667 10.1073/pnas.1121623109 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]31. Zhang X., Fan J., Wang S., Li Y., Wang Y., Li S. et al. . (2017) Targeting CD47 and autophagy elicited enhanced antitumor effects in non-small cell lung cancer. Cancer Immunol. Res. 5, 363–375 10.1158/2326-6066.CIR-16-0398 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]32. Nagatani K., Nawashiro H., Takeuchi S., Tomura S., Otani N., Osada H. et al. . (2013) Safety of intravenous administration of hydrogen-enriched fluid in patients with acute cerebral ischemia: initial clinical studies. Med. Gas. Res. 3, 13 10.1186/2045-9912-3-13 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]33. Yoritaka A., Takanashi M., Hirayama M., Nakahara T., Ohta S. and Hattori N. (2013) Pilot study of H(2) therapy in Parkinson’s disease: a randomized double-blind placebo-controlled trial. Mov. Disord. 28, 836–839 10.1002/mds.25375 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]34. Tamura T., Hayashida K., Sano M., Suzuki M., Shibusawa T., Yoshizawa J. et al. . (2016) Feasibility and safety of hydrogen gas inhalation for post-cardiac arrest syndrome-first-in-human pilot study. Circ. J. 80, 1870–1873 10.1253/circj.CJ-16-0127 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
