Водорода убива раковите клетки в белия дробНаучно Изследване

Потискането на автофагията улеснява апоптозата на белодробните ракови клетки, медиирани от водород
Публикувано онлайн 2020 г., 12 август. Линк към оригиналния текст – Doi: 10.3892/ol.2020.11973
Резюме
Предишното ни проучване установи, че водородният газ (H 2 ) може ефективно да инхибира прогресията на белодробния рак; основните механизми обаче все още предстои да бъдат изяснени. Настоящото изследване има за цел да изследва ролята на H 2 в автофагията на белодробен рак и да разкрие ефектите на автофагията върху H 2-посредствена апоптоза на рак на белия дроб и основните механизми. Нивата на експресия на протеини, свързани с клетъчна апоптоза и автофагия, бяха открити с помощта на Western blot анализ. Клетъчната автофагия се инхибира чрез лечение с 3-метиладенин или понижаване на Beclin1, докато рапамицин се използва за индуциране на автофагия. Клетъчният растеж и апоптозата бяха открити, като се използва комплект за преброяване на клетки-8 и тестове за цитометрия, съответно. Резултатите показват, че клетъчна апоптоза и автофагия са значително подобрени в А549 и H1975 белодробни ракови клетъчни линии, третирани с Н 2 . Въпреки това, автофагия повишаване отслабена Н 2 роли в насърчаването на клетъчна апоптоза и обратно. Освен това беше установено, че H 2лечение индуцирания маркиран понижение на нивата на протеин експресиране на фосфорилиран STAT3 и Bcl-2, и свръхекспресия на STAT3 премахнати Н 2 роли в насърчаването на клетъчна апоптоза и автофагия. Като цяло, настоящото изследване показва, че Н 2 може да стимулира клетъчен рак на белия дроб и апоптоза автофагия чрез инхибиране на активиране на STAT3 / Bcl-2 сигнализиране и потискане на автофагия може да подобри H 2 роли в насърчаването на рак на белия дроб клетъчна апоптоза.
Ключови думи: водороден газ, клетъчна апоптоза, клетъчна автофагия, STAT/Bcl2 сигнализиранеВъведение
Водородният газ (H 2 ), като вид ендогенен газ, е доказано, че не само служи като решаващ източник на енергия, но и играе решаваща роля във физиологичната регулация ( 1 ). Молекулите на водорода могат да влязат в тъканите и да упражняват противовъзпалителни, антиоксидантни и антиапоптотични роли ( 2 ). По -специално, H 2 показва висока безопасност и ефикасност за пациентите в клинични условия ( 3 ). Интравенозното приложение на 500 мл Н 2значително подобри еритема и свързаните с него симптоми при 4 пациенти с остри еритематозни кожни заболявания, без промени във физиологичните параметри, като телесна температура, кръвно налягане и пулс или влошаване на чернодробната и бъбречната функция. В допълнение, двама доброволци (единият за интравенозно приложение на H 2, а другият за инхалация на H 2 ) не демонстрираха дискомфорт ( 3 ). Напоследък H 2 се прилага и в клинични условия за подобряване на загубата на слуха, предизвикана от лъчетерапия при пациенти с рак на назофаринкса ( идентификатор ClinicalTrials.gov , NCT03818347 ) ( 4 ). В това проучване, H 2(67% водород и 33% кислород) се генерира с помощта на водород-кислородния пулверизатор чрез електролиза на вода и резултатите показват, че водород-кислородната терапия може значително да подобри бинауралния слух ( 4 ). Друго проучване от Фаза 1 ( идентификатор на ClinicalTrials.gov , NCT04046211 ) има за цел да изследва безопасността на H 2 върху здрави възрастни доброволци. В проучването са включени 8 доброволци, 2 от които са били изложени на 2,4% H 2 във медицински въздух за 24 часа, 2, които са били изложени на същия газ в продължение на 48 часа, а останалите 4 пациенти са били изложени на същия газ в продължение на 72 часа ( https://clinicaltrials.gov/ct2/show/ NCT04046211 ). В допълнение, Dole et al ( 5), предложен през 1975 г. за първи път, че H 2 има противораков потенциал. По същия начин, нашите изследвания група предварително установено, че Н 2 приложение значително потиска растежа на клетките, капацитет миграция и инвазия и индуцираната клетъчна апоптоза в белодробен рак А549 и H1975 клетки ( 6 ). Въпреки това, молекулярните механизми остават до голяма степен неизвестни.
Автофагията и апоптозата са незаменими биологични процеси и играят решаваща роля в индивидуалното развитие ( 7 ). Автофагията, известна още като макроавтофагия, е процес на „самоизяждане“, който поглъща цитоплазмени протеини, комплекси или органели в автофагозомата (цитоплазмена двойна мембранна структура), водеща до разграждане и рециклиране ( 8 ). Автофагията се модулира от свързани с автофагия гени (ATGs) чрез две еволюционно запазени убиквитиноподобни конюгационни системи, известни като ATG12-ATG5 и ATG8 система с лека верига 3 (LC3) -фосфатидилетаноламин (PE). Свързаният с микротубули протеин 1A/1B LC3BI е конюгиран с РЕ, за да стане LC3BII, който се свързва с външните и вътрешните мембрани на автофагозомата ( 9). Известно е, че автофагията поддържа клетъчната хомеостаза и предпазва от различни заболявания, включително рак ( 10 – 12 ). Неговата роля в канцерогенезата обаче е спорна. Натрупването на доказателства е установило, че автофагията е „двуостър меч“ в прогресията на рака ( 13 , 14 ).
Сигнален трансдюсер и активатор на транскрипция (STAT) 3 е латентен транскрипционен фактор, който модулира извънклетъчните сигнали чрез взаимодействие с полипептидни рецептори ( 15 ). STAT3 протеинът се активира транскрипционно предимно чрез фосфорилиране на тирозин, което след това се димеризира, транслокира към ядрото и се свързва със специфични за последователността ДНК елементи, което води до транскрипция на целеви гени ( 16 ). Установено е, че STAT3 служи като онкоген и често хипер-активиран при редица видове рак, включително рак на белия дроб, допринасящ за оцеляването, пролиферацията, метастазите и ангиогенезата на раковите клетки ( 17 , 18 ). В допълнение, STAT3 играе жизненоважна роля в процеса на автофагия ( 19). Например, Guo et al ( 20 ) съобщават, че потискането на STAT3 чрез неговия инхибитор, изокриптотаншинон засилва аутофагията в клетъчната линия на рак на белия дроб A549.
Настоящото изследване има за цел да изследва ефектите на H 2 върху аутофагията и апоптозата в белодробните ракови клетки и ролята на STAT3 в този процес. Резултатите показват, че Н 2 може да насърчи рак на белия дроб клетъчна апоптоза и автофагия чрез инхибиране на активиране на STAT3 / BCL2 сигналния път и потискане на автофагия може да подобри H 2 роли в насърчаването на рак на белия дроб клетъчна апоптоза.
Материали и методи
Клетъчни линии и култура
Клетъчните линии на човешки A549 и H1975 рак на белия дроб са закупени от American Type Culture Collection. Клетъчната линия A549 се култивира в среда F-12K, допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS), докато клетъчната линия H1975 се култивира в среда RPMI-1640, съдържаща 10% FBS (всички от Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. ). Две клетъчни линии се държат в инкубатор при 37 ° С с 5% СО 2 .
Клетъчна трансфекция и лечение
Три къси интерфериращи (si) РНК, използвани за заглушаване на Beclin1 (si-Beclin1-1/2-3; кат. № SR322490) в клетките A549 и H1975, и вектора на отрицателната контрола (si-NC, кат. № SR322490 ) са закупени от OriGene Technologies, Inc. използвайки реагента за трансфекция Lipofectamine ®2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) съгласно протоколите на производителя с 2 µg OE-STAT3/OE-NC или 0,3 µg si-Beclin1/si-NC за всяка ямка от 6-ямкова плака. След 48 часа трансфекция, клетките бяха събрани за анализ. СиРНК последователностите бяха както следва: si-NC, напред: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ′ и обратно: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3 ′; si-Beclin1-1, напред: 5′-CUGGACACGAGUUUCAAGATT-3 ′ и обратно: 5′-UCUUGAAACUCGUGUCCAGTT-3 ′; si-Beclin1-2, напред: 5′-GUGGAAUGGAAUGAGAUUATT-3 ′ и обратно: 5′-UAAUCUCAUUCCAUUCCACTT-3 ′; si-Beclin1-3, напред: 5′-GCUGCCGUUAUACUGUUCUTT-3 ′ и обратно: 5′-AGAACAGUAUAACGGCAGCTT-3 ′.
За лечение с H 2 , клетките A549 и H1975 се култивират в различни концентрации на H 2 (20, 40 и 60%) с помощта на Shanghai Nanobubble Technology Co., Ltd. ( http://www.nanobubble.cn/p- about.html? app = mb ) за различни времеви точки (12, 24, 36, 48 или 72 h) и 5% CO 2 служи като отрицателна контрола.
А549 и Н1975 клетките бяха третирани с 2 тМ 3-метиладенин (3-МА) или 100 цМ рапамицин (RAPA) за 48 часа, за да потиснат и индуцират съответно автофагия.
Western blot анализ
Общият протеин се екстрахира от клетките с помощта на буфер за лизис на RIPA (Sangon Biotech Co., Ltd.), съдържащ протеазен инхибитор (Beyotime Institute of Biotechnology) и съгласно инструкциите на производителя. След количествено определяне с набор от протеини на бицинхонинова киселина (Bio-Rad Laboratories, Inc.), 30 µg протеин от всяка проба се зарежда на лента и се отделя, използвайки 10% SDS-PAGE. След това протеините се прехвърлят върху мембрани от поливинилиден дифлуорид (EMD Millipore) и се блокират с 5% обезмаслено мляко при стайна температура за 1 час, след което мембраните се инкубират със следните първични антитела, за една нощ при 4 ° C: разцепена каспаза 3 (разреждане 1: 1000; кат. № ab2302; Abcam), разцепена поли ADP-рибоза полимераза (PARP; 1: 1000 разреждане; кат. № ab32064; Abcam), Beclin1 (разреждане 1: 2000; кат. № ab207612; Abcam), p62 (разреждане 1: 1000; кат. № ab56416; Abcam), LC3B (разреждане 1: 3 000; кат. № ab51520; Abcam), Bcl2 (разреждане 1: 1000; кат. № 15071; Технология за клетъчна сигнализация, Inc. .), STAT3 (разреждане 1: 1000; кат. № 9139; Cell Signaling Technology, Inc.), фосфорилиран (р) -STAT3 (разреждане 1: 1000; кат. № 9145; Cell Signaling Technology, Inc.) и β-актин (1: 4,000 разреждане; кат. № 3700; Cell Signaling Technology, Inc.). След инкубацията със съответните вторични антитела (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), нивата на експресия на протеин се откриват с помощта на Western blot образна и количествена система (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (версия 1.48; Национални здравни институти) след изваждане на фона, с β-актин като вътрешна справка. Abcam), LC3B (1: 3 000 разреждане; кат. № ab51520; Abcam), Bcl2 (1: 1 000 разреждане; кат. № 15071; Cell Signaling Technology, Inc.), STAT3 (1: 1 000 разреждане; кат. Не 9139; Cell Signaling Technology, Inc.), фосфорилиран (р) -STAT3 (разреждане 1: 1000; кат. № 9145; Cell Signaling Technology, Inc.) и β-актин (разреждане 1: 4 000; кат. 3700; Cell Signaling Technology, Inc.). След инкубацията със съответните вторични антитела (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), нивата на експресия на протеин се откриват с помощта на Western blot образна и количествена система (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (версия 1.48; Национални здравни институти) след изваждане на фона, с β-актин като вътрешна справка. Abcam), LC3B (1: 3 000 разреждане; кат. № ab51520; Abcam), Bcl2 (1: 1 000 разреждане; кат. № 15071; Cell Signaling Technology, Inc.), STAT3 (1: 1 000 разреждане; кат. Не 9139; Cell Signaling Technology, Inc.), фосфорилиран (р) -STAT3 (1: 1000 разреждане; кат. № 9145; Cell Signaling Technology, Inc.) и β-актин (1: 4,000 разреждане; кат. No. 3700; Cell Signaling Technology, Inc.). След инкубацията със съответните вторични антитела (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), нивата на експресия на протеин се откриват с помощта на Western blot образна и количествена система (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (версия 1.48; Национални здравни институти) след изваждане на фона, с β-актин като вътрешна справка. 000 разреждане; котка не. 15071; Cell Signaling Technology, Inc.), STAT3 (разреждане 1: 1000; кат. № 9139; Cell Signaling Technology, Inc.), фосфорилиран (р) -STAT3 (разреждане 1: 1000; кат. № 9145; Технология за клетъчна сигнализация , Inc.) и β-актин (разреждане 1: 4 000; кат. № 3700; Cell Signaling Technology, Inc.). След инкубацията със съответните вторични антитела (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), нивата на експресия на протеин се откриват с помощта на Western blot образна и количествена система (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (версия 1.48; Национални здравни институти) след изваждане на фона, с β-актин като вътрешна справка. 000 разреждане; котка не. 15071; Cell Signaling Technology, Inc.), STAT3 (разреждане 1: 1000; кат. № 9139; Cell Signaling Technology, Inc.), фосфорилиран (р) -STAT3 (разреждане 1: 1000; кат. № 9145; Технология за клетъчна сигнализация , Inc.) и β-актин (разреждане 1: 4 000; кат. № 3700; Cell Signaling Technology, Inc.). След инкубацията със съответните вторични антитела (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), нивата на експресия на протеин се откриват с помощта на Western blot образна и количествена система (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (версия 1.48; Национални здравни институти) след изваждане на фона, с β-актин като вътрешна справка. фосфорилиран (р) -STAT3 (1: 1000 разреждане; кат. № 9145; Cell Signaling Technology, Inc.) и β-актин (1: 4 000 разреждане; кат. № 3700; Cell Signaling Technology, Inc.). След инкубацията със съответните вторични антитела (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), нивата на експресия на протеин се откриват с помощта на Western blot образна и количествена система (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (версия 1.48; Национални здравни институти) след изваждане на фона, с β-актин като вътрешна справка. фосфорилиран (р) -STAT3 (1: 1000 разреждане; кат. № 9145; Cell Signaling Technology, Inc.) и β-актин (1: 4 000 разреждане; кат. № 3700; Cell Signaling Technology, Inc.). След инкубацията със съответните вторични антитела (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), нивата на експресия на протеин се откриват с помощта на Western blot образна и количествена система (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (версия 1.48; Национални здравни институти) след изваждане на фона, с β-актин като вътрешна справка. нивата на експресия на протеин са открити с помощта на Western blot образна и количествена система (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (версия 1.48; Национални здравни институти) след изваждане на фона, с β-актин като вътрешна справка. нивата на експресия на протеин са открити с помощта на Western blot образна и количествена система (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Количественото определяне на протеините се извършва с помощта на софтуера ImageJ (версия 1.48; Национални здравни институти) след изваждане на фона, с β-актин като вътрешна справка.