Газът H2 смекчава мозъчното увреждане при новородени плъховеНаучно Изследване

Резюме:

Неонаталната хипоксично-исхемична енцефалопатия (HIE) е водеща причина за смърт при новородени без ефективно лечение. Последните постижения във водородния (H2) газ предлагат обещаващ терапевтичен подход за исхемично реперфузионно увреждане; въздействието на този подход върху HIE обаче остава предмет на дебат. Ние оценихме терапевтичните ефекти на H2 газа върху HIE и основните молекулярни механизми в плъх модел на неонатално хипоксично-исхемично мозъчно увреждане (HIBI). Вдишването на H2 значително намалява невроналното увреждане и ефективно подобрява ранните неврологични резултати при новородени HIBI плъхове, както и ученето и паметта при възрастни. Този защитен ефект се свързва с времето на започване и продължителността на продължително вдишване на H2. Освен това, вдишването на H2 намалява експресията на Bcl-2-асоцииран X протеин (BAX) и каспаза-3, като същевременно насърчава експресията на Bcl-2, фактор 2, свързан с еритроиден фактор 2 и хем оксигеназа-1 (HO-1 ). H2 активирана екстрацелуларна сигнално-регулирана киназа и c-Jun N-терминална протеин киназа и дефосфорилирана р38 митоген-активирана протеин киназа (MAPK) в диференцирани с кислород-глюкоза/реперфузия (OGD/R) PC12 клетки на нервен растежен фактор. Инхибиторите на MAPK блокират H2-индуцираната HO-1 експресия. HO-1 малка интерферираща РНК намалява експресията на активиран от пероксизомен пролифератор рецептор гама коактиватор 1-алфа (PGC-1α) и сиртуин 1 (SIRT1) и обръща защитата на H2 срещу OGD/R-индуцирана клетъчна смърт. Тези открития предполагат, че H2 увеличава клетъчния антиоксидантен защитен капацитет чрез активиране на MAPK сигнални пътища, което води до експресия на HO-1 и последващо регулиране нагоре на експресията на PGC-1α и SIRT-1. По този начин, регулирането нагоре защитава NGF-диференцирани PC12 клетки от OGD/R-индуцирана окислителна цитотоксичност. В заключение, вдишването на H2 упражнява защитни ефекти върху неонатални плъхове с HIBI. Ранното започване и продължително вдишване на H2 имат по-добри защитни ефекти върху HIBI. Тези ефекти на H2 могат да бъдат свързани с антиоксидантни, антиапоптотични и противовъзпалителни реакции. HO-1 играе важна роля в H2-медиираната защита чрез MAPK/HO-1/PGC-1α пътя. Нашите резултати подкрепят по-нататъшна оценка на H2 като потенциално терапевтично средство за неврологични състояния, в които са замесени оксидативен стрес и апоптоза. 1. Предистория Неонаталната хипоксично-исхемична енцефалопатия (HIE) е тежко заболяване с висока неонатална заболеваемост и смъртност; 25% от преживелите HIE имат трайни неврологични дефекти [1]. Преди да настъпи необратимо мозъчно увреждане, специфичният патологичен процес на хипоксия-исхемия (HI) възниква чрез комбинация от множество механизми [2, 3]. Тежестта и продължителността на тези механизми определят степента на мозъчно увреждане при HIE [4]. Молекулярният водород (H2) лесно прониква през кръвно-мозъчната бариера и е нов антиоксидант [5]. Предишни проучвания показват, че H2 смекчава увреждането, предизвикано от исхемия/реперфузия (I/R-) на различни органи [6–8]. Въпреки това, невропротективните ефекти на лечението с H2 върху хипоксично-исхемично мозъчно увреждане (HIBI) са противоречиви. Например, скорошно проучване показа, че водата, обогатена с H2, упражнява невропротективни ефекти върху мозъчната тъкан след индукция на HIBI [9]. Друго проучване обаче не открива защитни ефекти [10]. Оксидативният стрес е добре позната последица от HIE и се счита за важен фактор за ранно мозъчно увреждане след HI [11], работещ в комбинация с възпаление [12]. Все повече доказателства сочат, че оксидативният стрес и невровъзпалението са в основата на разнообразен набор от заболявания на централната нервна система (ЦНС), включително инсулт, травматично увреждане на мозъка, множествена склероза, Алцхаймер, Паркинсон и други невродегенеративни заболявания [13–15]. Хем оксигеназа-1 (HO-1) е важен компонент на клетъчния защитен ензим, който се индуцира от и действа срещу индуцирано от оксидант I/R увреждане [16]. Свръхекспресията на HO-1 може също да повлияе на регулирането на гените на апоптотичния път като B-клетъчен лимфом 2 (Bcl-2), Bcl-2-свързан X протеин (BAS) и каспази [17]. HO-1 има антиневроинфламаторни и невропротективни свойства в ЦНС [18, 19]. По този начин терапиите, насочени към HO-1, могат да бъдат потенциални лечения за защита срещу възпаление, оксидативен стрес и апоптоза след HI. Съобщава се, че множество сигнални кинази, свързани с клетъчното оцеляване и пролиферация, регулират ядрената транслокация на HO-1. Митоген-активираните протеин кинази (MAPK) са едни от най-честите сигнални пътища, които служат за координиране на клетъчния отговор към различни извънклетъчни стимули [20]. Те са добре характеризирани при бозайници и включват c-Jun N-терминална киназа (JNK), p38 MAPK и извънклетъчна сигнал-регулирана киназа (ERK) [21, 22]. Активирането на MAPKs модулира експресията на HO-1 [23]. В това проучване ние оценихме невропротективните ефекти на H2 върху неонатални HIBI плъхове чрез поведенчески тестове, имунофлуоресценция и Western blot анализ, за да определим подходящия терапевтичен прозорец за H2. In vivo, ние също тествахме експресията на протеин B1 с висока подвижност на групата (HMGB1) и toll-подобен рецептор 4 (TLR-4), свързаните с апоптозата фактори Bcl-2/BAX-caspase3 и сигналните молекули за оксидативен стрес p38 MAPK/Nrf2/HO-1. След това изследвахме потенциалния MAPK/HO-1/пероксизомен пролифератор-активиран рецептор гама коактиватор 1-алфа (PGC-1α) сигнален път в диференцирани PC12 клетки с фактор на растеж на нервите (NGF-) след лишаване от кислород-глюкоза/реперфузия (OGD /R). 2. Методи 2.1. Експериментален дизайн In Vivo Общо 320 неонатални плъха бяха разделени на случаен принцип в следните осем групи (): HIBI, HIBI+H2-30 минути, HIBI+H2-60 минути, HIBI+H2-90 минути, HIBI+H2-90 минути (12 h), HIBI+H2-90 min (24 h), фиктивна хирургия и контрола. Животните в HIBI и всички групи за лечение с HIBI+H2 бяха плъхове с индуциран HIBI. След установяване на HIBI модела, неонаталните плъхове в групите HIBI+H2-30 минути, HIBI+H2-60 минути и HIBI+H2-90 минути бяха незабавно поставени в кутия за 30, 60 или 90 минути инхалация на H2, съответно. Това беше последвано от инхалиране на H2 два пъти дневно (30, 60 или 90 минути всеки път) през следващите 3 дни (7:00–9:00 сутринта и 7:00–9:00 вечерта). Животните в групите HIBI+H2-90 min (12 h) и HIBI+H2-90 min (24 h) са подложени на инхалация на 3% H2 за 90 min съответно на 12 и 24 h след индукция на HI. Това беше последвано от инхалация на H2 два пъти дневно за 90 минути в продължение на 3 дни. Животните в групата с фиктивна хирургия са подложени на изолиране на лява каротидна артерия без лигиране и предизвикване на хипоксия. Животните в контролната група са здрави неонатални плъхове без индукция на HIBI. Откриването на ранни неврологични рефлекси се извършва ~ 24 часа след индукция на HIBI и след това някои неонатални плъхове се подлагат на оцветяване с трифенилтетразолиев хлорид (TTC) (). На 96-ия час след индуциране на HIBI мозъчни проби от неонатални плъхове бяха събрани за Western blotting, вградени в парафин и разделени за крайна дезоксинуклеотидил трансфераза dUTP nick end маркиране (TUNEL) и имунофлуоресцентно оцветяване. В допълнение, някои от неонаталните плъхове () в зряла възраст (следродилни дни 70–74) са подложени на тестване във воден лабиринт на Морис (Фигура 1). Проучването е проведено в заслепен и рандомизиран въпрос по отношение на прилагането на лечението и хистологичните и функционални оценки.